方法
(一)萃取溶媒開發
參考港標平貝母的分析方法,由於標準品西貝母素(sipeimine)含量很低,因此取5 g川貝母粉進行分析。
1. 取5 g之市售貝母粉末(經20 mesh過篩),分別置入50 mL濃縮瓶中。
2. 加入10 mL的氨水靜置1小時。
3. 加入100 mL的20% MeOH/CHCl3,80 ℃加熱回流萃取2小時。
4. 使用1號濾紙過濾後將濾液減壓濃縮乾燥。
5. 加入1 mL的MeOH回溶後過濾(0.22 μm, nylon)。
(二)萃取次數考察
取本品粉末約5 g,置50 mL濃縮瓶中,加入10 mL氨水靜置1小時,加入100 mL 20% MeOH/CHCl3 溶劑,80 ℃回流萃取2小時。以1號濾紙過濾後將濾液減壓濃縮乾燥,用1 mL甲醇回溶後過濾(filter, 0.22 μm)即得。每針20 μL注入HPLC,殘渣部分重複上述方法多次萃取、進樣,直到指標成分被萃取完全,並選出最佳萃取次數。
(三)對照標準品溶液
取標準品西貝母素(sipeimine)精確秤定1.88 mg,加1 mL的甲醇製成每1 mL含西貝母素(sipeimine) 1880 μg的標準品儲備溶液。
(四)檢品溶液
取本品粉末約5 g,置50 mL濃縮瓶中,加入10 mL氨水靜置1小時,加入100 mL 20% MeOH/CHCl3 溶劑,80 ℃回流萃取2小時。以1號濾紙過濾後將濾液減壓濃縮乾燥,用1 mL甲醇回溶後過濾(filter, 0.22 μm)。
(五)測定法
分別精確吸取標準品溶液、檢品溶液20 μL注入HPLC測定,用檢量線計算溶液中西貝母素(sipeimine)的含量。
(六)檢量線
精確吸取西貝母素(sipeimine)標準品儲備溶液適量 (1880 mg/mL),以甲醇稀釋成含西貝母素(sipeimine) 1880、940、118、94、59 mg/mL的標準品溶液。以上溶液各取20 μL分別注入HPLC進行定量分析,利用標準品之波峰面積(y軸)和標準品之濃度(x軸)進行線性迴歸,並求得檢量線之方程式y=ax+b與相關係數R2。
(七)精密度試驗
以西貝母素(sipeimine)濃度為235 mg/mL之標準品溶液連續進樣3針,以西貝母素(sipeimine)波峰面積為指標,求出相對標準差。
(八)再現性與穩定性試驗
1. 再現性:取同一家市售川貝母粉末,依川貝母檢品溶液製備方法平行 製備3份川貝母檢品溶液進樣測定,以西貝母素(sipeimine)含量(%)為指標,求出相對標準差。
2. 穩定性:取同一家市售川貝母粉末,依川貝母檢品溶液製備方法製備川貝母檢品溶液,分別在0、8和24小時進樣測定,以西貝母素(sipeimine)波峰面積為指標,求出相對標準差。
(九)偵測極限與定量極限試驗
偵測極限(limit of detection, LOD):將已知濃度之標準品溶液不斷稀釋,並以訊號雜訊比為≧ 3:1時之濃度,作為偵測極限估計值;定量極限(limit of quantitation, LOQ):將已知濃度之標準品溶液不斷稀釋,並以訊號雜訊比為≧10:1時之濃度,作為定量極限估計值。
(十)同日間與異日間試驗
取西貝母素濃度為59, 118和 235 mg/mL之標準品溶液進行同日間測試(在0及8小時每個濃度注射三次)與異日間測試(在0, 8及24小時每個濃度注射三次),求其相對標準偏差值(%)以評估HPLC分析條件之穩定性與再現性。
(十一)添加回收率試驗
平行製備的三分檢品溶液分別取50、100和100 μL,添加西貝母素(Sipeimine)濃度為706 mg/mL之混合標準品溶液100、100和50 μL。每次取20 μL注入HPLC,每個檢品進行三重複。 |