（一）萃取溶媒開發

    取本品粉末9份(經60 mesh過篩)，每份精確稱定0.5 g，置20 mL樣品瓶中，精確加入乙醇、75%乙醇、50%乙醇、25%乙醇、甲醇、80%甲醇、50%甲醇、25%甲醇、H₂O各10 mL，超音波震盪處理(功率200 W，頻率40 kHz) 30分鐘，搖勻並以No. 1濾紙過濾，取得濾液，並定容至25 mL，再過濾(Syringe filter, 0.45 μm)，即得。每針10 μL注入高效能液相層析儀(HPLC)，以所測得每克重量之最大波峰面積為最佳澤蘭萃取溶媒。

（二）萃取次數考察

取本品粉末約0.5 g，精確稱定，置20 mL樣品瓶中，精確加入75%乙醇 10 mL，超音波震盪處理(功率200W，頻率40 kHz) 30分鐘，搖勻並以No. 1濾紙過濾至10 mL之定量瓶中，加75%乙醇至刻度，搖勻，再過濾(Syringe filter, 0.45 μm)，取濾液，即得。每針20 μL注入HPLC，殘渣部分重複上述方法多次萃取、進樣，直到指標成分被萃取完全，並選出最佳萃取次數。

（三）對照標準品溶液

取標準品香豆素(Coumarin)精確稱定2.0 mg，加1.0 mL的75%乙醇製成每1 mL含香豆素(Coumarin) 2000 μg的標準品儲備溶液。

（四）檢品溶液

取本品粉末約0.5 g，精確稱定，置20 mL樣品瓶中，精確加入75%乙醇10 mL，超音波震盪處理(功率200W，頻率40 kHz) 30分鐘，以No. 1濾紙過濾至20 mL之定量瓶中，殘渣部分重複提取一次，合併濾液，加75%乙醇至刻度，搖勻再過濾(syringe filter, 0.45 μm)，取濾液，即得。

（五）測定法

分別精確吸取標準品溶液、檢品溶液各20 μL，注入HPLC測定，經檢量線計算溶液中香豆素(Coumarin)的含量，即得。

（六）檢量線

精確吸取香豆素(Coumarin)標準品儲備溶液適量(2000 μg/mL)，以75%乙醇連續稀釋製成含香豆素(Coumarin)分別為250、100、50.0、25.0、10.0 μg/mL的標準品溶液。以上溶液各取20 μL分別注入HPLC進行定量分析，利用標準品之波峰面積(y軸)和標準品之濃度(x軸)進行線性回歸，並求得檢量線之方程式y=ax+b與相關係數R²。

（七）精密度試驗

以香豆素(Coumarin)濃度為50.0 μg/mL之標準品儲備液連續進樣五針，以香豆素(Coumarin)波峰面積為指標，求出相對標準差。

（八）再現性與穩定性試驗

1. 再現性：取同一家市售澤蘭粉末，依澤蘭檢品溶液製備方法平行製備五份澤蘭檢品溶液，進樣測定，以香豆素(Coumarin)含量(%)為指標，求出相對標準差。
2. 穩定性：取同一家市售澤蘭粉末，依澤蘭檢品溶液製備方法製備澤蘭檢品溶液，分別在0、2、4、8、16、24小時進樣測定，以香豆素(Coumarin)波峰面積為指標，求出相對標準差。

（九）偵測極限與定量極限試驗

偵測極限(limit of detection, LOD)：將已知濃度之標準品溶液不斷稀釋，並以訊號雜訊比為≧3:1時之濃度，作為偵測極限估計值；定量極限(limit of quantitation, LOQ)：將已知濃度之標準品溶液不斷稀釋，並以訊號雜訊比為≧10:1時之濃度，作為定量極限估計值。

（十）同日間與異日間試驗

取25.0、50.0、250 μg/mL之香豆素(Coumarin)標準品溶液進行同日間測試(intra-day test；在24小時內每個濃度重複注射三次)與異日間測試(inter-day test；7天內注射三次，每次間隔24小時以上，每個濃度重複注射三次)，求其相對標準差(R.S.D.，%)以評估液相層析儀分析條件之穩定性及再現性。

（十一）添加回收率試驗

取已知香豆素(Coumarin)含量的澤蘭藥材粉末約0.5 g，精確稱定三份，分別加入0.2、0.5、0.75 mg的香豆素(Coumarin)，並按檢品溶液製備方法操作測定。