方法
(一)萃取溶媒開發
取本品粉末五份,每份精確稱定約0.5 g,置50 mL離心管中,各精確加入30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇與水50 mL,超音波震盪處理(功率500 W,頻率40 kHz) 30分鐘。各提取液離心(3000 rpm, 15分鐘),過濾(Syringe filter, 0.45 μm),取濾液,即得。每針10 μL注入高效液相層析儀(HPLC),以所測得每克重量之最大波峰面積之溶媒為女貞子最佳萃取溶媒。
(二)萃取次數考察
取本品粉末約0.5 g,精確秤定,置50 mL離心管中,精密加入50%乙醇50 mL,超音波震盪處理(功率500 W,頻率40 kHz) 30分鐘,離心(3000 rpm, 15分鐘),取上清液,過濾(Syringe filter, 0.45 μm),取濾液,即得。殘渣部分重複上述方法再次萃取、進樣,直到指標成分被萃取完全,並選出最佳萃取次數。
(三)對照標準品溶液
取特女貞苷(Nüzhenide)精確稱定25 mg,加10 mL的50%乙醇製成每1 mL含特女貞苷(Nüzhenide) 2.5 mg的標準品儲備溶液。
(四)檢品溶液
取本品粉末精確稱定0.5 g,置50 mL離心管中,精確加入50%乙醇50 mL,超音波震盪處理(功率500 W,頻率40 kHz) 30分鐘。將提取液離心(3000 rpm, 15分鐘),取上清液並過濾(Syringe filter, 0.45 μm),取濾液,即得。
(五)測定法
分別精確吸取標準品溶液10 μL、檢品溶液20 μL,注入HPLC,測定,用標準曲線計算溶液中特女貞苷(Nüzhenide)的含量,即得。
(六)檢量線
精確吸取特女貞苷(Nüzhenide)標準品儲備溶液適量(2.5 mg/mL),以50%乙醇稀釋製成含特女貞苷(Nüzhenide)分別為2.5 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.05 mg/mL、0.025 mg/mL的標準品溶液。以上溶液各取10 μL分別注入HPLC進行定量分析,利用標準品之波峰面積(y軸)和標準品之濃度(x軸)進行線性回歸,並求得檢量線之方程式y = ax + b與相關係數R2。
(七)精密度試驗
以特女貞苷(Nüzhenide)濃度為0.25 mg/mL之標準品液連續進樣五針,以特女貞苷(Nüzhenide)波峰面積為指標,求出相對標準偏差。
(八)再現性與穩定性試驗
1. 再現性:取同一家市售女貞子粉末,依女貞子檢品溶液製備方法平行製備五份女貞子檢品溶液,進樣測定,以特女貞苷(Nüzhenide)波峰面積為指標,求出相對標準差。
2. 穩定性:取同一家市售女貞子粉末,依女貞子檢品溶液製備方法製備一份女貞子檢品溶液,分別在0、2、4、8、24小時進樣測定,以特女貞苷(Nüzhenide)波峰面積為指標,求出相對標準差。
(九)偵測極限與定量極限試驗
偵測極限(Limit of Detection, LOD):將已知濃度之標準品溶液不斷稀釋,並以訊號雜訊比≧3:1時之濃度,作為偵測極限估計值;定量極限(Limit of Quantitation, LOQ):將已知濃度之標準品溶液不斷稀釋,並以訊號雜訊比≧10:1時之濃度,作為定量極限估計值。
(十)同日間與異日間差異試驗
取0.25 mg/mL之標準品溶液進行同日間測試(在24小時內進樣三次)與異日間測試(七天內進樣三次,每次間隔24小時以上),求其相對標準差,以評估HPLC分析條件之穩定性與再現性。
(十一)添加回收率試驗
取已知特女貞苷(Nüzhenide)含量的藥材粉末約0.25 g,精確稱定5份,分別置50 mL離心管,再分別精確加入0.125 mg/mL特女貞苷(Nüzhenide) 25 mL, 超音波震盪處理(功率500 W,頻率40 kHz) 30分鐘。將提取液離心(3000 rpm, 15分鐘),取上清液並過濾(Syringe filter, 0.45 μm),取濾液,即得,進樣10 μL。 |