(一)最佳萃取溶媒開發
取本品粉末六份,每份精確稱定0.1 g,置50 mL三角錐形瓶中,精確加入甲醇、75%甲醇、50%甲醇、乙醇、75%乙醇、50%乙醇各20 mL,超音波震盪處理(功率300 W,頻率40 kHz) 30分鐘,冷卻後以No. 2濾紙過濾,取得濾液搖勻再過濾(Syringe filter, 0.45 μm),即得。每針10 μL注入高效能液相層析儀(HPLC),以所測得每克藥材之標準品對甲氧基肉桂酸乙酯(Ethyl p-methoxycinnamate)最大波峰面積為最佳山柰萃取溶媒。
(二)最佳萃取次數評估
取本品粉末約0.1 g (過第20號篩網),精確稱定,置50 mL三角錐形瓶中,精確加入50%甲醇20 mL,超音波震盪處理(功率300 W,頻率40 kHz) 30分鐘,冷卻後以No. 2濾紙過濾,濾液加50%甲醇定容至20 mL,搖勻再過濾(Syringe filter, 0.45 μm),取濾液,即得。每針10 μL注入HPLC,殘渣部分重複上述方法多次萃取、進樣,直到指標成分被萃取完全,並選出最佳萃取次數。
(三)對照標準品溶液
取標準品對甲氧基肉桂酸乙酯(Ethyl p-methoxycinnamate)精確稱定1.0 mg,加1 mL的甲醇製成每1 mL含對甲氧基肉桂酸乙酯(Ethyl p-methoxycinnamate) 1000 μg的標準品儲備溶液,並以甲醇稀釋至50 μg/mL製成對照標準品溶液。
(四)檢品溶液
取本品粉末(過第20號篩網)約0.1 g,精確稱定,置50 mL錐形瓶中,精確加入50%甲醇20 mL,超音波震盪處理(功率300 W,頻率40 kHz) 30分鐘,以No.2濾紙過濾至40 mL之定量瓶中,殘渣部分重複提取一次,合併濾液,加50%甲醇至刻度,搖勻再過濾(Syringe filter, 0.45 μm),即得。
(五)測定法
分別精確吸取對照標準品溶液(50 μg/mL)、檢品溶液10 mL,注入HPLC,測定,用標準曲線計算溶液中對甲氧基肉桂酸乙酯(Ethyl p-methoxycinnamate)的含量,即得。
(六)檢量線
精確吸取對甲氧基肉桂酸乙酯(Ethyl p-methoxycinnamate)標準品儲備溶液適量(1000 μg/mL),以甲醇稀釋製成含對甲氧基肉桂酸乙酯(Ethyl p-methoxycinnamate)分別為250、200、150、100、50、10、5.0 μg/mL的標準品溶液。以上溶液各取10 μL分別注入HPLC進行定量分析,利用標準品之波峰面積(y軸)和標準品之濃度(x軸)進行線性回歸,並求得檢量線之方程式y=ax+b與相關係數R2。
(七)精確度試驗
以對甲氧基肉桂酸乙酯(Ethyl p-methoxycinnamate)濃度為50μg/mL之對照標準品溶液連續進樣五針,以對甲氧基肉桂酸乙酯(Ethyl p-methoxycinnamate)波峰面積為指標,求出相對標準差。
(八)再現性與穩定性試驗
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再現性:取同一批市售山柰粉末,依山柰檢品溶液製備方法平行製備五份山柰檢品溶液,進樣測定,以對甲氧基肉桂酸乙酯(Ethyl p-methoxycinnamate)含量(%)為指標,求出相對標準差。
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穩定性:取同一批市售山柰粉末,依山柰檢品溶液製備方法製備山柰檢品溶液,分別在0、2、4、8、16、24小時進樣測定,以對甲氧基肉桂酸乙酯(Ethyl p-methoxycinnamate)波峰面積為指標,求出相對標準差。
(九)偵測極限與定量極限試驗
偵測極限(limit of detection, LOD):將已知濃度之標準品溶液不斷稀釋,並以訊號雜訊比為≧3:1時之濃度,作為偵測極限估計值;定量極限(limit of quantitation, LOQ):將已知濃度之標準品溶液不斷稀釋,並以訊號雜訊比為≧10:1時之濃度,作為定量極限估計值。
(十)添加回收率試驗
取已知對甲氧基肉桂酸乙酯(Ethyl p-methoxy cinnamate)含量的山柰藥材粉末約0.1 g,精確稱定五份,分別加入1 mL的對甲氧基肉桂酸乙酯(Ethyl p-methoxycinnamate)溶液(2.6 mg/mL),並按檢品溶液製備方法操作測定。 |