方法
（一）最佳萃取溶媒開發
標準品為烏藥醚內酯:
取本品粉末七份，每份精確稱定1 .0 g，置100 mL三角錐形瓶中，精密加入甲醇、75%甲醇、50%甲醇、乙醇、75%乙醇、50%乙醇、水各25mL，超音波震盪處理(功率300 W，頻率40 kHz) 30分鐘，冷卻後以No. 1濾紙過濾，取得濾液搖勻再過濾(Syringe filter, 0.22 μm)，即得。每針10 μL注入高效能液相層析儀(HPLC)，以所測得每克重量之標準品烏藥醚內酯(Linderane)最大波峰面積為最佳烏藥萃取溶媒。
標準品為去甲異波爾定:
取本品粉末八份，每份精確稱定1 .0 g，置100 mL三角錐形瓶中，精確加入甲醇、75%甲醇、50%甲醇、乙醇、75%乙醇、50%乙醇、水、0.5%鹽酸與甲醇(1:2, v/v)各25mL，超音波震盪處理(功率300 W，頻率40 kHz) 30分鐘，冷卻後以No. 1濾紙過濾，取得濾液搖勻再過濾(Syringe filter, 0.22 μm)，即得。每針10 μL注入高效能液相層析儀(HPLC)，以所測得每克重量之標準品去甲異波爾定(Norisoboldine)最大波峰面積為最佳烏藥萃取溶媒。
（二）最佳萃取次數評估
標準品為烏藥醚內酯:
取本品粉末約1.0 g (過第20號篩網)，精確稱定，置100 mL三角錐形瓶中，精確加入甲醇25 mL，超音波震盪處理(功率300 W，頻率40 kHz) 30分鐘，冷卻後以No.1濾紙過濾，濾液加甲醇定容至25 mL，搖勻再過濾(Syringe filter, 0.22 μm)，取濾液，即得。每針10 μL注入HPLC，殘渣部分重複上述方法多次萃取、進樣，直到指標成分被萃取完全，並選出最佳萃取次數。
標準品為去甲異波爾定:
取本品粉末約1.0 g (過第20號篩網)，精確稱定，置100 mL三角錐形瓶中，精確加入0.5%鹽酸與甲醇(1:2, v/v) 25 mL，超音波震盪處理(功率300 W，頻率40 kHz) 30分鐘，冷卻後以No.1濾紙過濾，濾液加0.5%鹽酸與無水甲醇(1:2, v/v)定容至25 mL，搖勻再過濾(Syringe filter, 0.22 μm)，取濾液，即得。每針10 μL注入HPLC，殘渣部分重複上述方法多次萃取、進樣，直到指標成分被萃取完全，並選出最佳萃取次數。
（三）對照標準品溶液
標準品為烏藥醚內酯:
取標準品烏藥醚內酯(Linderane)精確稱定1.0 mg，加1 mL的甲醇製成每1 mL含烏藥醚內酯(Linderane) 1000 μg的標準品儲備溶液，並以甲醇稀釋至50 μg/mL製成對照標準品溶液。
標準品為去甲異波爾定:
取標準品去甲異波爾定(Norisoboldine)精確稱定1.0 mg，加1 mL的0.5%鹽酸與甲醇(1:2, v/v)，製成每1 mL含去甲異波爾定(Norisoboldine) 1000 μg的標準品儲備溶液，並以0.5%鹽酸與甲醇(1:2, v/v)稀釋至200 μg/mL製成對照標準品溶液。
（四）檢品溶液
標準品為烏藥醚內酯:
取本品粉末(過第20號篩網)約1.0 g，精確稱定，置100 mL三角錐形瓶中，精確加入甲醇25 mL，超音波震盪處理(功率300 W，頻率40 kHz) 30分鐘，以No.1濾紙過濾。殘渣部分重複提取1次，合併濾液，減壓濃縮至少量，轉移至25 mL之定量瓶中，加入溶媒至刻度，搖勻再過濾(Syringe filter, 0.22 μm)，即得。
標準品為去甲異波爾定:
取本品粉末(過第20號篩網)約1.0 g，精確稱定，置100 mL三角錐形瓶中，精確加入0.5%鹽酸與甲醇 (1:2, v/v) 25 mL，超音波震盪處理(功率300 W，頻率40 kHz) 30分鐘，以No.1濾紙過濾。殘渣部分重複提取1次，合併濾液，減壓濃縮至少量，轉移至25 mL之定量瓶中，加入溶媒至刻度，搖勻再過濾(Syringe filter, 0.22 μm)，即得。
（五）測定法
標準品為烏藥醚內酯:
分別精確吸取對照標準品溶液(50 μg/mL)、檢品溶液10 μL，注入HPLC，測定，用標準曲線計算溶液中烏藥醚內酯(Linderane)的含量，即得。
標準品為去甲異波爾定:
分別精確吸取對照標準品溶液(200 μg/mL)、檢品溶液10 μL，注入HPLC，測定，用標準曲線計算溶液中去甲異波爾定(Norisoboldine)的含量，即得。
（六）檢量線
標準品為烏藥醚內酯:
精確吸取烏藥醚內酯(Linderane)標準品儲備溶液適量(1000 μg/mL)，以甲醇稀釋製成含烏藥醚內酯(Linderane)分別為400、200、100、50、25 μg/mL的標準品溶液。以上溶液各取10 μL分別注入HPLC進行定量分析，利用標準品之波峰面積(y軸)和標準品之濃度(x軸)進行線性回歸，並求得檢量線之方程式y=ax+b與相關係數R2。
標準品為去甲異波爾定:
精確吸取去甲異波爾定(Norisoboldine)標準品儲備溶液適量(1000 μg/mL)，以0.5%鹽酸與甲醇(1:2, v/v)稀釋製成含去甲異波爾定(Norisoboldine)分別為800、400、200、100、50 μg/mL的標準品溶液。以上溶液各取10 μL分別注入HPLC進行定量分析，利用標準品之波峰面積(y軸)和標準品之濃度(x軸)進行線性回歸，並求得檢量線之方程式y=ax+b與相關係數R2。
（七）精密度試驗
標準品為烏藥醚內酯:
以烏藥醚內酯(Linderane)濃度為50 μg/mL之標準品溶液連續進樣五針，以烏藥醚內酯(Linderane)波峰面積為指標，求出相對標準差。
標準品為去甲異波爾定:
以去甲異波爾定(Norisoboldine)濃度為200 μg/mL之標準品儲溶液連續進樣五針，以去甲異波爾定(Norisoboldine)波峰面積為指標，求出相對標準差。
（八）再現性與穩定性試驗
標準品為烏藥醚內酯:
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再現性:取同一批市售烏藥粉末，依烏藥檢品溶液製備方法平行製備五份烏藥檢品溶液，進樣測定，以烏藥醚內酯(Linderane)含量(%)為指標，求出相對標準差。
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穩定性:取同一批市售烏藥粉末，依烏藥檢品溶液製備方法製備烏藥檢品溶液，分別在0、2、4、8、16、24小時進樣測定，以烏藥醚內酯(Linderane)波峰面積為指標，求出相對標準差。
標準品為去甲異波爾定:
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再現性:取同一批市售烏藥粉末，依烏藥檢品溶液製備方法平行製備五份烏藥檢品溶液，進樣測定，以去甲異波爾定(Norisoboldine)含量(%)為指標，求出相對標準差。
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穩定性:取同一批市售烏藥粉末，依烏藥檢品溶液製備方法製備烏藥檢品溶液，分別在0、2、4、8、16、24小時進樣測定，以去甲異波爾定(Norisoboldine)波峰面積為指標，求出相對標準差。
（九）偵測極限與定量極限試驗
偵測極限(Limit of Detection, LOD)：將已知濃度之標準品溶液不斷稀釋，並以訊號雜訊比為≧3:1時之濃度，作為偵測極限估計值；定量極限(Limit of Quantitation, LOQ)：將已知濃度之標準品溶液不斷稀釋，並以訊號雜訊比為≧10:1時之濃度，作為定量極限估計值。
（十）添加回收率試驗
標準品為烏藥醚內酯:
取已知烏藥醚內酯(Linderane)含量的烏藥藥材粉末約0.5 g，精確稱定五份，分別加入1 mL的烏藥醚內酯(Linderane)溶液(100 μg/mL)，並按檢品溶液製備方法操作測定。 |
