方法
（一）最佳萃取溶媒開發
取本品粉末五份，每份精確稱定0.5 g，置50 mL三角錐形瓶中，精確加入甲醇、75%甲醇、乙醇、75%乙醇和丙酮各25 mL，超音波震盪處理(功率300 W，頻率40 kHz) 30分鐘，冷卻後以No. 1濾紙過濾，取得濾液搖勻再過濾(syringe filter, 0.45 μm)，即得。每針10 μL注入高效能液相層析儀(HPLC)，以所測得之標準品最大波峰面積為最佳紫草萃取溶媒。
（二）最佳萃取次數評估
取本品粉末約0.5 g，精確稱定，置50 mL三角錐形瓶中，精確加入丙酮25 mL，超音波震盪處理(功率300 W，頻率40 kHz) 30分鐘，冷卻後以No. 1濾紙過濾，濾液加丙酮至25 mL，搖勻再過濾(syringe filter, 0.45 μm)，取濾液，即得。每針10 μL注入HPLC，殘渣部分重複上述方法多次萃取、進樣，直到指標成分被萃取完全，並選出最佳萃取次數。
（三）對照標準品溶液
取標準品乙醯紫草素(Acetylalkannin)，以及β,β-二甲基丙烯醯阿卡寧((β,β-Dimethylacryl)alkannin)各精確稱定1.0 mg，各加入1 mL的甲醇，製成每1 mL含乙醯紫草素(Acetylalkannin) 1000 μg的標準品儲備溶液，以及每1 mL 含β,β-二甲基丙烯醯阿卡寧((β,β-Dimethylacryl)alkannin) 1000 μg的標準品儲備溶液，並分別以甲醇稀釋至80 μg/mL製成對照標準品溶液。
（四）檢品溶液
取本品粉末(過20號篩網)約0.5 g，精確稱定，置50 mL錐形瓶中，精確加入丙酮25 mL，超音波震盪處理(功率300 W，頻率40 kHz) 30分鐘，以No. 1濾紙過濾，至25 mL之定量瓶中，加丙酮至刻度，搖勻再過濾(syringe filter, 0.45 μm)，取濾液，即得。
（五）測定法
分別精確吸取對照標準品溶液、檢品溶液10 μL，注入HPLC，測定，用標準曲線計算溶液中乙醯紫草素(Acetylalkannin)及β,β-二甲基丙烯醯阿卡寧((β,β-Dimethylacryl)alkannin)的含量，即得。
（六）檢量線
精確吸取乙醯紫草素(Acetylalkannin)標準品儲備溶液(1000 μg/mL)適量，以甲醇稀釋製成含乙醯紫草素(Acetylalkannin)分別為400、200、100、80、40及20 μg/mL的標準品溶液。以上溶液各取10 μL分別注入HPLC進行定量分析，利用標準品之波峰面積(y軸)和標準品之濃度(x軸)進行線性回歸，並求得檢量線之方程式y=ax+b與相關係數R2。
精確吸取β,β-二甲基丙烯醯阿卡寧((β,β-Dimethylacryl)alkannin)標準品儲備溶液(1000 μg/mL)適量，以甲醇稀釋製成含β,β-二甲基丙烯醯阿卡寧((β,β-Dimethylacryl)alkannin)分別為400、200、100、80及40 μg/mL的標準品溶液。以上溶液各取10 μL分別注入HPLC進行定量分析，利用標準品之波峰面積(y軸)和標準品之濃度(x軸)進行線性回歸，並求得檢量線之方程式y=ax+b與相關係數R2。
（七）精確度試驗
以乙醯紫草素(Acetylalkannin)濃度為80 μg/mL之對照標準品溶液連續進樣五針，以乙醯紫草素(Acetylalkannin)的波峰面積為指標，求出相對標準差。以β,β-二甲基丙烯醯阿卡寧((β,β-Dimethylacryl)alkannin)濃度為80 μg/mL之對照標準品溶液連續進樣五針，以β,β-二甲基丙烯醯阿卡寧((β,β-Dimethylacryl)alkannin)的波峰面積為指標，求出相對標準差。
（八）再現性與穩定性試驗
1. 再現性：取同一批市售紫草粉末，依紫草檢品溶液製備方法平行製備五份紫草檢品溶液，進樣測定，以乙醯紫草素(Acetylalkannin)以及β,β-二甲基丙烯醯阿卡寧((β,β-Dimethylacryl)alkannin)的含量(%)為指標，求出相對標準差。
2. 穩定性：取同一批市售紫草粉末，依紫草檢品溶液製備方法製備紫草檢品溶液，分別在0、2、4、8、16、24小時進樣測定，以乙醯紫草素(Acetylalkannin)以及β,β-二甲基丙烯醯阿卡寧((β,β-Dimethylacryl)alkannin)的波峰面積為指標，求出相對標準差。
（九）偵測極限與定量極限試驗
偵測極限(limit of detection, LOD)：將已知濃度之標準品溶液不斷稀釋，並以訊號雜訊比為≧3:1時之濃度，作為偵測極限估計值；定量極限(limit of quantitation, LOQ)：將已知濃度之標準品溶液不斷稀釋，並以訊號雜訊比為≧10:1時之濃度，作為定量極限估計值。
（十）添加回收率試驗
取已知乙醯紫草素(Acetylalkannin)含量的紫草藥材粉末約0.25 g，精確稱定五份，分別加入1 mL的乙醯紫草素(Acetylalkannin)溶液(1000 μg/mL)，並按檢品溶液製備方法操作測定。
取已知β,β-二甲基丙烯醯阿卡寧((β,β-Dimethylacryl)alkannin)含量的紫草藥材粉末約0.25 g，精確稱定五份，分別加入1 mL的β,β-二甲基丙烯醯阿卡寧((β,β-Dimethylacryl)alkannin)溶液(1000 μg/mL)，並按檢品溶液製備方法操作測定。 |
