中醫藥品質分析(qaTCM)
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威靈仙
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威靈仙(Clematidis Radix)

四、方法

(一)對照標準品溶液

  取標準品常春藤皂苷元(Hederagenin)精確稱定2.0 mg,加1 mL的甲醇製成每1 mL含常春藤皂苷元(Hederagenin) 2000 μg的標準品儲備溶液,並以甲醇稀釋至750 μg/mL製成對照標準品溶液。

  取標準品齊墩果酸(Oleanolic acid)精確稱定2.0 mg,加1 mL的甲醇製成每1 mL含齊墩果酸(Oleanolic acid) 2000 μg的標準品儲備溶液,並以甲醇稀釋至600 μg/mL製成對照標準品溶液。

 

(二)檢品溶液

  取本品粉末(過第20號篩網)約1.0 g,精確稱定,置250 mL濃縮瓶,精確加入乙酸乙酯100 mL,加熱迴流2小時,去除乙酸乙酯液,晾乾殘渣,殘渣轉移於50 mL離心管,加甲醇25 mL,超音波震盪處理(功率300 W,頻率40 kHz) 30分鐘,再以No. 2濾紙過濾,取濾液。殘渣部分重複提取2次,合併濾液,轉移至50 mL之定量瓶中,加入溶媒至刻度,再將濾液轉移至100 mL濃縮瓶,用濃縮機減壓蒸乾,濃縮物溶於7.3% (w/v)鹽酸30 mL,加熱迴流2小時,冷卻至室溫,取溶液轉移於125 mL分液漏斗中,用乙酸乙酯振搖提取3次,每次30 mL。合併乙酸乙酯提取液,轉移至100 mL圓底燒瓶中,用濃縮機減壓蒸乾,濃縮物溶於甲醇,轉移於10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,再過濾(Syringe filter, PTFE 0.22 μm),即得。

 

(三)測定法       

  分別精確吸取常春藤皂苷元(Hederagenin)對照標準品溶液、檢品溶液10 μL,注入HPLC,測定,用標準曲線分別計算溶液中常春藤皂苷元(Hederagenin)的含量,即得。

  分別精確吸取齊墩果酸(Oleanolic acid)對照標準品溶液、檢品溶液10 μL,注入HPLC,測定,用標準曲線分別計算溶液中齊墩果酸(Oleanolic acid)的含量,即得。

 

(四)檢量線

  精確吸取常春藤皂苷元(Hederagenin)標準品儲備溶液適量(2000 μg/mL),以甲醇稀釋成含常春藤皂苷元(Hederagenin)分別為1000、750、250、100 μg/mL的標準品溶液。以上溶液各取10 μL分別注入HPLC進行定量分析,利用標準品之波峰面積(y軸)和標準品之濃度(x軸)進行線性回歸,並求得檢量線之方程式y = ax + b與相關係數R2

  精確吸取齊墩果酸(Oleanolic acid)標準品儲備溶液適量(2000 μg/mL),以甲醇稀釋成含齊墩果酸(Oleanolic acid)分別為1000、600、250、100 μg/mL的標準品溶液。以上溶液各取10 μL分別注入HPLC進行定量分析,利用標準品之波峰面積(y軸)和標準品之濃度(x軸)進行線性回歸,並求得檢量線之方程式y = ax + b與相關係數R2

 

(五)精密度試驗

  以常春藤皂苷元(Hederagenin)濃度為750 μg/mL之對照標準品溶液連續進樣五針,以常春藤皂苷元(Hederagenin)波峰面積為指標,求出相對標準差。

  以齊墩果酸(Oleanolic acid)濃度為600 μg/mL之對照標準品溶液連續進樣五針,以齊墩果酸(Oleanolic acid)波峰面積為指標,求出相對標準差。

 

(六)再現性與穩定性試驗

1. 再現性:取同一批市售威靈仙粉末,依威靈仙檢品溶液製備方法平行製備五份威靈仙檢品溶液,進樣測定,分別以常春藤皂苷元(Hederagenin)、齊墩果酸(Oleanolic acid)的含量(%)為指標,求出相對標準差。

2. 穩定性:取同一批市售威靈仙粉末,依威靈仙檢品溶液製備方法製備威靈仙檢品溶液,分別在0、2、4、8、16、24小時進樣測定,以常春藤皂苷元(Hederagenin) 、齊墩果酸(Oleanolic acid)波峰面積為指標,求出相對標準差。

 

(七)偵測極限與定量極限試驗

  偵測極限(Limit of Detection, LOD):將已知濃度之標準品溶液不斷稀釋,並以訊號雜訊比為≧3:1時之濃度,作為偵測極限估計值;定量極限(Limit of Quantitation, LOQ):將已知濃度之標準品溶液不斷稀釋,並以訊號雜訊比為≧10:1時之濃度,作為定量極限估計值。

 

(八)添加回收率試驗

    取已知常春藤皂苷元(Hederagenin) 、齊墩果酸(Oleanolic acid)含量的威靈仙藥材粉末約0.05 g,精確稱定五份,分別加入1 mL的常春藤皂苷元(Hederagenin)溶液(700 μg/mL)、1 mL的齊墩果酸(Oleanolic acid)溶液(500 μg/mL),並按檢品溶液製備方法操作測定。