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威靈仙

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方法

威靈仙

生藥名：CLEMATIDIS RADIX ET RHIZOMA

英文名：Clematis Root

基原：本品為毛茛科Ranunculaceae植物威靈仙Clematis chinensis Osbeck之乾燥根及根莖。

一、方法

(一)	檢品溶液	【萃取方法1】(臺灣中藥典第二版2013) ──取本品粉末1.0 g，加甲醇10 mL，超音波處理30分鐘，過濾，取濾液作為檢品溶液。【萃取方法2】(修飾中華人民共和國藥典2015) ──取本品粉末1.0 g，加乙醇50 mL，超音波處理30分鐘，過濾，濾液濃縮至乾，殘渣加乙醇20 mL使之溶解，加濃鹽酸3 mL，加熱迴流1小時，加水10 mL，待冷卻後，加正己烷25 mL振搖萃取，取正己烷層液濃縮至乾，殘渣加甲醇10 mL使之溶解，作為檢品溶液。【萃取方法3】(修飾香港中藥材標準第六冊) P ──取本品粉末1.0 g，加乙酸乙酯100 mL，加熱迴流2小時，待冷卻後過濾，棄濾液，殘渣揮乾後，加甲醇25 mL，超音波處理30分鐘，過濾，重複超音波處理2次，合併濾液，濾液濃縮至乾，殘渣加7.3% (w/v)鹽酸30 mL使之溶解，加熱迴流2小時，待冷卻後，用乙酸乙酯振搖萃取3次，每次30 mL，合併乙酸乙酯層液並濃縮至乾，殘渣加甲醇使之溶解，定容至10 mL，作為檢品溶液。
(二)	對照標準品溶液	取常春藤皂苷元(Hederagenin)及齊墩果酸(Oleanolic acid)對照標準品，加甲醇製成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照標準品溶液。
(三)	薄層板	HPTLC silica gel 60 F₂₅₄，10 cm × 10 cm、20 cm × 10 cm
(四)	展開劑	【展開劑1】 (臺灣中藥典第二版2013) ──二氯甲烷：乙醇 (9：1) 【展開劑2】 (中華人民共和國藥典2015) ──甲苯：乙酸乙酯：甲酸 (20：3：0.2) 【展開劑3】 (修飾香港中藥材標準第六冊) ──正己烷：乙酸乙酯：甲酸 (5：3：0.1) 【展開劑4】 (自行開發) P ──二氯甲烷：甲醇 (15：1)
(五)	展開槽	10 cm × 10 cm、20 cm × 10 cm
(六)	展開	展開槽預先平衡 15分鐘，上行展開，展開距離8 cm。
(七)	顯色&檢視	以10%硫酸乙醇試液(H₂SO₄/EtOH TS)噴霧後，105 ℃加熱至條帶顯色清晰，於主波長365 nm之紫外燈照射下檢視。

溶媒系統與觀察方式

萃法選擇及濃度測試

實驗日期：106/06/29

相對溼度(RH)：54%

溫度(RT)：26 ℃

【展開劑4】 (自行開發) ──二氯甲烷：甲醇 (15：1)

編號	名稱	點注量
1，2，3	常春藤皂苷元(Hederagenin) (0.5 mg/mL)	1，2，5 μL
4，5，6	齊墩果酸(Oleanolic acid) (0.5 mg/mL)	1，2，5 μL
7，8，9	檢品溶液1【萃取方法1】	2，5，8 μL
10，11，12	檢品溶液1【萃取方法2】	2，5，8 μL
13，14，15	檢品溶液1【萃取方法3】	2，5，8 μL

建議萃法：唯【萃取方法2】及【萃取方法3】之檢品溶液中有分離與檢出標準品常春藤皂苷元及齊墩果酸，而由於條帶顯示較多，故選擇【萃取方法3】。

建議點注量：常春藤皂苷元(Hederagenin)標準品溶液1 μL，齊墩果酸(Oleanolic acid)標準品溶液1 μL，檢品溶液【萃取方法3】2 μL。

溶媒系統選擇

實驗日期：106/06/30

相對溼度(RH)：57%

溫度(RT)：25 ℃

【展開劑1】 (臺灣中藥典第二版2013) ──二氯甲烷：乙醇 (9：1)

【萃取方法3】(修飾香港中藥材標準第六冊) ── HPTLC 10%硫酸乙醇呈色後紫外光(365 nm)檢出(常春藤皂苷元R_f值為0.60，齊墩果酸R_f值為0.82)

【展開劑2】 (中華人民共和國藥典2015) ──甲苯：乙酸乙酯：甲酸 (20：3：0.2)

【萃取方法3】(修飾香港中藥材標準第六冊) ── HPTLC 10%硫酸乙醇呈色後紫外光(365 nm)檢出(常春藤皂苷元R_f值為0.03，齊墩果酸R_f值為0.24)

【展開劑3】 (修飾香港中藥材標準第六冊) ──正己烷：乙酸乙酯：甲酸 (5：3：0.1)

【萃取方法3】(修飾香港中藥材標準第六冊) ── HPTLC 10%硫酸乙醇呈色後紫外光(365 nm)檢出(常春藤皂苷元R_f值為0.31，齊墩果酸R_f值為0.67)

【展開劑4】 (自行開發) ──二氯甲烷：甲醇 (15：1)

【萃取方法3】(修飾香港中藥材標準第六冊) ── HPTLC 10%硫酸乙醇呈色後紫外光(365 nm)檢出(常春藤皂苷元R_f值為0.30，齊墩果酸R_f值為0.58)

1：Blank

2：常春藤皂苷元(Hederagenin)

3：齊墩果酸(Oleanolic acid)

4，5：檢品溶液1

6：Spike

建議溶媒系統：以【萃取方法3】方式，4種展開劑展開皆可從檢品溶液中分離與檢出常春藤皂苷元及齊墩果酸，而由於展開溶媒製備較簡便，且條帶顯示較多，故採用自行開發之【展開劑4】。

觀察方式選擇

實驗日期：106/06/30

相對溼度(RH)：57%

溫度(RT)：25 ℃

【展開劑4】 (自行開發) ──二氯甲烷：甲醇 (15：1)
【萃取方法3】(修飾香港中藥材標準第六冊) ─ HPTLC紫外光(254 nm)檢出	【萃取方法3】(修飾香港中藥材標準第六冊) ─ HPTLC紫外光(365 nm)檢出

【萃取方法3】(修飾香港中藥材標準第六冊) ─ HPTLC呈色/可見光檢出	【萃取方法3】(修飾香港中藥材標準第六冊) ─ HPTLC呈色/紫外光(365 nm)檢出P

1：Blank

2：常春藤皂苷元(Hederagenin)

3：齊墩果酸(Oleanolic acid)

4，5：檢品溶液1

6：Spike

建議觀察方式：經10%硫酸乙醇呈色後，於紫外光(365 nm)檢視較其他觀察方式有較多明顯之條帶及常春藤皂苷元(Hederagenin)與齊墩果酸(Oleanolic acid)標準品斑點。

十批樣品檢測

實驗日期：106/06/30

相對溼度(RH)：57%

溫度(RT)：25 ℃

【展開劑4】 (自行開發) ──二氯甲烷：甲醇 (15：1)
【萃取方法3】(修飾香港中藥材標準第六冊) ─ HPTLC 10%硫酸乙醇呈色後紫外光(365 nm)檢出

1	Blank
2	常春藤皂苷元(Hederagenin) (0.5 mg/mL)
3	齊墩果酸(Oleanolic acid) (0.5 mg/mL)
4，5	檢品溶液1 (NB)
6，7	檢品溶液2 (NC)
8，9	檢品溶液3 (NI)
10，11	檢品溶液4 (NN)
12，13	檢品溶液5 (CA)
14	Spike (檢品溶液1)


1	Blank
2	常春藤皂苷元(Hederagenin) (0.5 mg/mL)
3	齊墩果酸(Oleanolic acid) (0.5 mg/mL)
4，5	檢品溶液6 (CG)
6，7	檢品溶液7 (SA)
8，9	檢品溶液8 (SC)
10，11	檢品溶液9 (SG)
12，13	檢品溶液10 (SJ)
14	Spike (檢品溶液1)

結論與建議：以修飾香港中藥材標準第六冊之【萃取方法3】方式，並以自行開發之【展開劑4】分離與檢出常春藤皂苷元(Hederagenin)與齊墩果酸(Oleanolic acid)較佳，以10%硫酸乙醇顯色後，於紫外光(365 nm)下檢視較佳。

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