方法
(一)萃取溶媒開發
取本品粉末七份,每份精確稱定1.0 g,置125 mL三角錐形瓶中,精確加入甲醇、75%甲醇、50%甲醇、乙醇、75%乙醇、50%乙醇、水各12.5 mL,超音波震盪處理(功率200W,頻率40 kHz) 30分鐘,以No. 1濾紙過濾至25 mL之定量瓶中,加入溶媒至刻度,搖勻、過濾(Syringe filter, 0.45 μm),取濾液即得。每針10 μL注入高效能液相層析儀(HPLC),以所測得每克重量之最大波峰面積為最佳小茴香萃取溶媒。
(二)萃取次數考察
取本品粉末約1.0 g,精確秤定,置125 mL三角錐形瓶中,精確加入甲醇12.5 mL,超音波震盪處理(功率200 W,頻率40 kHz) 30分鐘,以No.1濾紙過濾至25 mL之定量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,過濾(Syringe filter, 0.45 μm),取濾液,即得。每針10 μL注入HPLC,殘渣部分重複上述方法多次萃取、進樣,直到指標成份被萃取完全,並選出最佳萃取次數。
(三)對照標準品溶液
取標準品反式茴香腦(trans-anethole)精確稱定1.0 mg,加1 mL的甲醇製成每1 mL含反式茴香腦(trans-anethole)1000 μg的標準品儲備溶液。
(四)檢品溶液
取本品粉末約1.0 g,精確秤定,置125 mL三角錐形瓶中,精確加入甲醇12.5 mL,超音波震盪處理(功率200 W,頻率40 kHz) 30分鐘,以No. 1濾紙過濾至25 mL之定量瓶中,殘渣部分重複提取一次,合併濾液,加甲醇至刻度,搖勻再過濾(Syringe filter, 0.45 μm),取濾液,即得。
(五)測定法
分別精確吸取標準品溶液、檢品溶液10 μL,注入HPLC測定,用標準曲線計算溶液中反式茴香腦(trans-anethole)的含量,即得。
(六)檢量線
精確吸取反式茴香腦(trans-anethole)標準品儲備溶液適量(1000 μg/mL),以甲醇稀釋製成含反式茴香腦(trans-anethole)分別為125 μg/mL、62.5 μg/mL、31.25 μg/mL、15.625 μg/mL、7.8125 μg/mL的標準品溶液。以上溶液各取10 μL分別注入HPLC進行定量分析,利用標準品之波峰面積(y軸)和標準品之濃度(x軸)進行線性回歸,並求得檢量線之方程式y=ax+b與相關係數R2。
(七)精密度試驗
以反式茴香腦(trans-anethole)濃度為62.5 μg/mL之標準品儲備液連續進樣五針,以反式茴香腦(trans-anethole)波峰面積為指標,求出相對標準差。
(八)再現性與穩定性試驗
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再現性:取同一家市售小茴香粉末,依小茴香檢品溶液製備方法平行製備五份小茴香檢品溶液,進樣測定,以反式茴香腦(trans-anethole)含量(%)為指標,求出相對標準差。
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穩定性:取同一家市售小茴香粉末,依小茴香檢品溶液製備方法製備小茴香檢品溶液,分別在0、2、4、8、16、24小時進樣測定,以反式茴香腦(trans-anethole)鋒面積為指標,求出相對標準差。
(九)同日間與異日間試驗
取125、62.5、31.25 μg/ mL之反式茴香腦(trans-anethole)標準品溶液進行同日間測試(在24小時內每個濃度注射三次)與異日間測試(七天內注射三次,每次間隔24小時以上,每個濃度重複注射三次),求其相對標準偏差值(%)以評估HPLC分析條件之穩定性與再現性。
(十)偵測極限與定量極限試驗
偵測極限(Limit of Detection, LOD):將已知濃度之標準品溶液不斷稀釋,並以訊號雜訊比為≧ 3:1時之濃度,作為偵測極限估計值;定量極限(Limit of Quantitation, LOQ):將已知濃度之標準品溶液不斷稀釋,並以訊號雜訊比為≧10:1時之濃度,作為定量極限估計值。
(十一)添加回收率試驗
取已知反式茴香腦(trans-anethole)含量的小茴香藥材粉末約0.5 g,精確稱定五份,分別加入0.391 mg的反式茴香腦(trans-anethole),並按檢品溶液製備方法操作測定。
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