(一) 萃取次數考察
取本品粉末約1.0 g,精確稱定,置100 mL三角錐形瓶中,精確加入無水乙醇20 mL,超音波震盪處理(功率200 W,頻率40 kHz) 30分鐘,放置室溫,以No.1濾紙過濾至20 mL定量瓶中,加入溶媒至刻度,搖勻,過濾(Syringe filter, 0.45 μm),取濾液,即得。每針10 μL注入高效能液相層析儀(HPLC),殘渣部分重複上述方法多次萃取、進樣,直到指標成份被萃取完全,並選出最佳萃取次數。
(二) 對照標準品溶液
取標準品路路通酸(Betulonic acid)精確稱定1.0 mg,加1 mL的無水乙醇配製成每1 mL含路路通酸(Betulonic acid) 1000 μg的標準品儲備溶液。
(三) 檢品溶液
取本品粉末約1.0 g,精確稱定,置100 mL三角錐形瓶中,精確加入無水乙醇20 mL,超音波震盪處理(功率200 W,頻率40 kHz) 30分鐘,放置室溫,以No.1濾紙過濾。殘渣部分重複提取兩次,合併濾液,蒸乾,殘渣加無水乙醇溶解,轉移至20 mL之定量瓶中,加入溶媒至刻度,搖勻,過濾(Syringe filter, 0.45 μm),取濾液,即得。
(四) 測定法
分別精確吸取標準品溶液、檢品溶液各10 μL,注入HPLC測定,用標準曲線計算溶液中路路通酸(Betulonic acid)的含量,即得。
(五) 檢量線
精確吸取路路通酸(Betulonic acid)標準品儲備溶液適量(1000 μg/mL),以無水乙醇稀釋製成含路路通酸(Betulonic acid)分別為62.5 μg/mL、125 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL、1000 μg/mL的標準品溶液。以上溶液各取10 μL分別注入HPLC進行定量分析,利用標準品之波峰面積(y軸)和標準品之濃度(x軸)進行線性回歸,並求得檢量線之方程式y=ax+b與相關係數R2。
(六) 精密度試驗
以路路通酸(Betulonic acid)濃度為62.5 μg/mL之標準品儲備液連續進樣五針,以路路通酸(Betulonic acid)波峰面積為指標,求出相對標準差。
(七) 再現性與穩定性試驗
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再現性:取同一家市售路路通粉末,依路路通檢品溶液製備方法平行製備五份路路通檢品溶液,進樣測定,以路路通酸(Betulonic acid)含量(%)為指標,求出相對標準差。
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穩定性:取同一家市售路路通粉末,依路路通檢品溶液製備方法製備路路通檢品溶液,分別在0、2、4、8、16、24小時進樣測定,以路路通酸(Betulonic acid)波峰面積為指標,求出相對標準差。
(八) 同日間與異日間試驗
取125、250、500 μg/ mL之路路通酸(Betulonic acid)標準品溶液進行同日間測試(在24小時內每個濃度注射三次)與異日間測試(七天內注射三次,每次間隔24小時以上,每個濃度重複注射三次),求其相對標準偏差值(%)以評估HPLC分析條件之穩定性與再現性。
(九) 偵測極限與定量極限試驗
偵測極限(Limit of Detection, LOD):將已知濃度之標準品溶液不斷稀釋,並以訊號雜訊比為≧ 3:1時之濃度,作為偵測極限估計值;定量極限(Limit of Quantitation, LOQ):將已知濃度之標準品溶液不斷稀釋,並以訊號雜訊比為≧10:1時之濃度,作為定量極限估計值。
(十) 添加回收率試驗
取已知路路通酸(Betulonic acid)含量的路路通藥材粉末約0.5 g,精確稱定三份,分別加入0.4 mg、0.8 mg、1.2 mg的路路通酸(Betulonic acid),並按檢品溶液製備方法操作測定。 |