方法

（一）最佳萃取溶媒開發

    取本品粉末六份，每份精確稱定0.5 g，置50 mL三角錐形瓶中，精確加入甲醇、75%甲醇、50%甲醇、乙醇、75%乙醇、50%乙醇各10 mL，超音波震盪處理(功率500 W，頻率60 Hz) 30分鐘，冷卻後以No. 1濾紙過濾，取得濾液再濃縮至乾，並以2 mL甲醇回溶，搖勻再過濾(Syringe filter, 0.45 μm)即得。每針20 μL注入高效能液相層析儀(HPLC)，以所測得每克重量之標準品芒柄花素(Formononetin)最大波峰面積為最佳雞血藤萃取溶媒。

（二）最佳萃取次數評估

    取本品粉末約0.5 g (過第20號篩網)，精確稱定，置50 mL三角錐形瓶中，精確加入75%甲醇10 mL，超音波震盪處理(功率500 W，頻率60 Hz) 30分鐘，冷卻後以No. 1濾紙過濾，取得濾液再濃縮至乾，並以2 mL甲醇回溶，搖勻再過濾(Syringe filter, 0.45 μm)即得。每針20 μL注入HPLC，殘渣部分重複上述方法多次萃取、進樣，直到指標成分被萃取完全，並選出最佳萃取次數。

• 對照標準品溶液

取標準品芒柄花素(Formononetin)精確稱定1.0 mg，加1 mL的甲醇製成每1 mL含芒柄花素(Formononetin) 1000 μg的標準品儲備溶液，並以甲醇稀釋至10 μg/mL製成對照標準品溶液。

• 檢品溶液

    取本品粉末(過第20號篩網)約0.5 g，精確稱定，置50 mL錐形瓶中，精確加入75%甲醇10 mL，超音波震盪處理(功率500 W，頻率60 Hz) 30分鐘，以No.1濾紙過濾至40 mL之定量瓶中，殘渣部分重複提取一次，合併濾液，加75%甲醇至刻度，搖勻再濃縮至乾，精確加入2 mL甲醇回溶，搖勻後過濾(Syringe filter, 0.45 μm)，即得。

• 測定法

    分別精確吸取對照標準品溶液芒柄花素(Formononetin) (10 μg/mL)檢品溶液20 mL，注入HPLC，測定，用標準曲線計算溶液中芒柄花素(Formononetin)的含量，即得。

• 檢量線

精確吸取芒柄花素(Formononetin)標準品儲備溶液適量(1000 μg/mL)，以甲醇稀釋製成含芒柄花素(Formononetin)分別為50、25、10、5、2.5及1.0 μg/mL的標準品溶液。以上溶液各取20 μL分別注入HPLC進行定量分析，利用標準品之波峰面積(y軸)和標準品之濃度(x軸)進行線性回歸，並求得檢量線之方程式y=ax+b與相關係數R²。

• 精確度試驗

以芒柄花素(Formononetin)濃度為10 μg/mL之對照標準品溶液連續進樣五針，以芒柄花素(Formononetin)波峰面積為指標，求出相對標準差。

• 再現性與穩定性試驗

1. 再現性：取同一批市售雞血藤粉末，依雞血藤檢品溶液之製備方法平行製備五份雞血藤檢品溶液，進樣測定，以芒柄花素(Formononetin)含量(%)為指標，求出相對標準差。
2. 穩定性：取同一批市售雞血藤粉末，依雞血藤檢品溶液之製備方法製備雞血藤檢品溶液，分別在0、2、4、8、16、24小時進樣測定，以芒柄花素(Formononetin)波峰面積為指標，求出相對標準差。

(九）偵測極限與定量極限試驗

    偵測極限(limit of detection, LOD)：將已知濃度之標準品溶液不斷稀釋，並以訊號雜訊比為≧3:1時之濃度，作為偵測極限估計值；定量極限(limit of quantitation, LOQ)：將已知濃度之標準品溶液不斷稀釋，並以訊號雜訊比為≧10:1時之濃度，作為定量極限估計值。

(十）添加回收率試驗

    取已知芒柄花素(Formononetin)含量的雞血藤藥材粉末約0.5 g，精確稱定五份，分別加入芒柄花素(Formononetin)溶液(30 μg/mL)，並按檢品溶液製備方法操作測定。